有关工程化的神经干细胞的研究进展论文
1992年Reynolds等[1]首次从成年鼠的纹状体和海马中分离出能够自我更新的多潜能细胞群落，首此提出神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)的概念。由于神经干细胞具备自我更新能力和多分化潜能的生物学特性，为中枢神经系统疾病的治愈带来了新的希望。随着神经干细胞分离培养技术的日渐成熟，并伴随着基因工程技术飞速发展，研究者们可根据不同的科研目的，对神经干细胞进行不同的基因工程改造，工程化的神经干细胞随之孕育而生。
1 工程化神经干细胞的构建
工程化神经干细胞移植治疗技术是目前治疗中枢神经系统疾病最具前景的治疗方法之一。研究者们通过基因工程技术，将不同的目的基因片段成功构建于脂质体或病毒载体上，之后再将其成功导入神经干细胞，这种受基因调控神经干细胞比其他普通干细胞在治疗中枢神经系统疾病上具有优势。目前神经干细胞工程化的研究主要表现在以下几个方面：(1)神经干细胞作为治疗基因的载体，在其中插入不同目的基因的基础片段，使神经干细胞的功能性细化，与转入的目的基因产生协同效果，达到更有效的治疗效果;(2)可示踪的神经干细胞，通过基因工程将某些可示踪的报告基因成功导入神经干细胞中，标记将要进行移植的神经干细胞，使移植后的神经干细胞在体内增殖、分化等过程更为有利地、直观地观察和研究;(3)永生化的神经干细胞，通过基因技术的改造，阻止神经干细胞的分化，使细胞在空间上处于未分化状态，并使细胞体外传代能力得到提高，永生化神经干细胞不仅提高了移植治疗的安全性及高效性，同时符合伦理道德研究，为神经干细胞研究提供了更为宽广的平台。
1.1 基因治疗的工程化神经干细胞
中枢神经系统疾病发病原因主要由于在中枢神经系统中某种特定的细胞先天性发育不良、后天损伤以及退行性变甚至死亡，这些原因造成神经系统中细胞难以或不能分泌功能性的细胞因子及神经组织结构的破坏。基因治疗技术开始于20世纪70年代，经过数十年的发展基因治疗技术已经得到长足的进步。研究者们利用基因治疗技术，并整合神经干细胞的生物特性，充分运用于中枢神经系统疾病的治疗，携带目的基因的神经干细胞移植进病患体内，起到基因修复、基因置换及基因增强的作用，恢复因为疾病所造成的细胞、组织或器官的生理功能缺陷。目前以神经干细胞为靶细胞基因治疗主要包括，一是以调控神经干细胞的分化功能为主，导入神经干细胞的目的基因在移植体中可控制细胞向所缺失的细胞方向分化。二是以基因修复或置换为主，在基因治疗过程当中，在不涉及移植体中其他基因组的改变，矫正基因的异常序列达到治疗的效果。最后是以神经干细胞导入具有基因增强效果的目的基因，修复以破坏的神经组织，并分泌各种细胞因子，以保护神经系统。神经干细胞基因治疗始于治疗帕金森病，是中枢神经系统疾病基因治疗的开端和代表，Anton等成功构建了酪氨酸羟化酶为目的基因神经干细胞，并将其移植进帕金森病模型大鼠的纹状体中，实验结果显示构建的神经干细胞对帕金森病治疗效果明显并无明显异常表现。在中枢神经系统自身免疫性疾病方面，Klose等用转染白介素-10基因的神经干细胞治疗自身免疫性脑脊髓炎，发现神经干细胞可作为白介素-10的稳定载体，使白介素-10成功表达，同时调节T细胞改善疾病的病程。对于神经干细胞分化、增殖方面，宋川等采用PCR、分子克隆与测序技术成功构建CDK52pEGFP表达质粒，后将CDK52基因片段成功转染入体外培养的神经干细胞中，研究显示CDK52成功表达后对神经干细胞具有明显的促分化后神经细胞的轴突生长、形态成熟，细胞分化明显、细胞多数为典型的神经元样或胶质细胞样。在中枢神经系统损伤、坏死性疾病方面，汪雷等采用NEP1-40作为靶基因，神经干细胞作为载体细胞，在体外成功建立了能表达NEP1-40的神经干细胞，将神经干细胞转入脊髓损伤大鼠模型并通过行为学判断对脊髓损伤的影响，结果显示基因修饰后的干细胞能够进一步提高脊髓损伤恢复效果。Kim 等应用逆转录病毒作载体将VEGF转至神经干细胞并移植到大鼠脊髓损伤部位，发现转染细胞6周后神经干细胞增殖明显，多数分化为成熟的少突胶质细胞，并且VEGF在治疗中增加了脊髓损伤部位的血管密度及增强了神经组织的保护作用。在神经系统肿瘤方面，闫超等利用慢病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV7-TK)融合基因转染神经干细胞，并将神经干细胞植入C6胶质瘤动物模型体中，观察发现植入神经干细胞的实验组较对照组肿瘤体积有明显的缩小，转染了CK-TK 基因的神经干细胞对胶质瘤细胞有抑制作用，与其他单一自杀基因相比抗肿瘤效果更佳明显。Karen等利用神经干细胞向胶质瘤细胞定向迁移能力且抑制肿瘤生长的特性，构建了具有胞嘧啶脱氨酶(CD)基因片段的神经干细胞，并与5-氟胞嘧啶联合移植入动物模型体内，病理结果显示神经干细胞核型正常且抑制肿瘤组织生长效果明显，这种联合移植对于5-氟胞嘧啶安全性更加稳定。中枢神经系统发育的演变过程极为的复杂，在不同的演变过程当中，不同的基因在其水平范围内起到的效果也不尽相同。基因工程改造的神经干细胞作为治疗疾病的新型技术，能整合于神经干细胞上的目的基因主要集中在细胞周期调节因子、肿瘤坏死因子、肿瘤信号转导因子等。目前，能够与目的基因成功的整合成功是神经干细胞工程化的现阶段研究重点。
1.2 可示踪的工程化神经干细胞
在神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病中，干细胞在活体中所起到的效用作用是显著的，但论其治疗过程如神经干细胞在移植体中存活、迁移、分化等情况还不尽完善，合适的示踪剂能够帮助研究者们在无创性条件下识别及监测神经干细胞治疗的过程及机制。神经干细胞导入可标志性的基因片段，能够很好地观测移植后神经干细胞治疗过程的生物学变化。常用的标志基因主要有大肠杆菌乳糖操纵子中的β-半乳糖苷酶(LacZ)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)。研究表明逆转录病毒中可以插入LacZ、GFP等标记分子，通过感染分裂期的细胞，使标志基因得以表达，这样就可以对神经干细胞的增殖、迁移、分化的全部过程进行监测。其中以荧光蛋白标记GFP 应用较多，1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞中表达了能发射绿色荧光的GFP，开创了GFP研究与应用先河。近年来，研究发现MRI对示踪活体神经干细胞的分辨能力具有较强的表现，但在实际工作中发现某些疾病与正常组织的T1甚至T2弛像时间无明显差别或差别不明显，另外，虽然有些病变异常信号表达较高，但诊断与鉴别诊断仍较困难，这些情况下就需要应用MR增强剂。超顺磁性氧化铁和超小顺磁性氧化铁可在体外标记神经干细胞，这种示踪剂具有一种独特的性质--超顺磁性，通过其独有的性质对神经干细胞进行标记，并利用MRI显像技术就可对神经干细胞移植治疗的过程进行全程观测。国内有研究表明在构建后的帕金森大鼠模型中植入被超顺磁性氧化铁标记的神经干细胞，移植1周后MRI显像上可见移植区的变化呈低信号;10周后，移植区低信号表现在T2梯度回波仍可被观察到，证明了利用示踪剂超顺磁性氧化铁所标记的神经干细胞，在MRI显像上能够清晰地显示出其分布和存活情况。除去以上标记神经干细胞方法外，常用的标记方法还有利用细胞核中插入DNA 双链染料，非分离细胞的标记技术，Y染色体标记等方法。尽管在可示踪工程化神经干细胞上取得许多的进展，但在无创性条件下利用影像学技术依旧不能很好的从细胞水平显示神经干细胞治疗的全部过程。
1.3 永生化神经干细胞
永生化指的是在细胞发展的过程当中，利用基因工程化技术使细胞周期的连续性得以保存。通过体外基因调控神经干细胞得以永生化，其最常用的方法是将编码后的癌基因蛋白的部分基因片段利用逆转录病毒载体转导入胚胎神经干细胞中，细胞终末分化被阻止，在空间上处于未分化状态，细胞的传代能力被提高。目前证实不同部位、不同年龄结构的神经干细胞，通过转入不同形式的myc、nen、p53、腺病毒EIA以及SV40大T抗原使其具有永生化。细胞的自发性永生化几率非常小，人类细胞的__永生化几率更是罕见。因此，研究者们努力提高永生化的发生率，利用基因转染等技术手段，主要将各种外源性永生化基因导入靶细胞当中例如病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等达到细胞永生化的目的。端粒是存在于染色体末端，有重复的TTAGGG序列，它具有防止染色体降解、端端融合、重排和染色体丢失等功能，研究者们对多种永生细胞的端粒长度检测时发现，永生化细胞分裂过程当中其端粒并未出现丢失的现象，这有可能提示细胞增殖能力的无限化可能与端粒长度的维持有某种必然的联系，这为神经干细胞永生化提供了相对的理论机制。神经干细胞具有良好的多分化潜能，而永生化的神经干细胞是否能够依然保持这种良好的特性。研究发现，多数永生化神经干细胞制备主要是通过利用温度敏感型突变SV40大T抗原，然而分析表明这种制备的永生化神经干细胞，癌基因的表达不能够被充分地下调，如果去尝试使细胞最终分化将会导致细胞的凋亡。因此，在构建永生化神经干细胞时，若能充分下调癌基因的表达并使其具有可调控性是十分重要的，同时我们又要考虑到神经干细胞的分化情况，若能构建不需要营养生长因子而能使细胞分化为目的细胞的系统那就更为的理想。Hoshimarn等使用了四环素控制的基因表达系统，通过逆转录病毒载体构建了LINXVmyc，并稳定转染于体外分离培养的成年鼠海马神经干细胞，这种神经干细胞在体外可以稳定地转染克隆，v-myc转录是可被四环素所调节的，当在细胞培养液中添加四环素后，本身分裂的细胞停止分裂，并且在添加四环素5 d后，NFH 阳性的细胞占绝大多数，tau阳性细胞半数以上，Vimentin为阴性，这些现象说明癌基因表达可被低浓度四环素所调控，呈现下调趋势，且细胞分化较为彻底。近年，有研究者成功建立了一种永生化神经干细胞系，通过转染技术将外源性人端粒酶催化亚单位基因导入体外培养的神经干细胞中，建立了永生化神经干细胞系，这种神经干细胞不仅保存了基本特性，而且在长期的体外培养中可传至50代仍生长旺盛，分裂速度更加地迅速，可作为种子细胞。永生化神经干细胞作为合适的体外转基因治疗载体，较普通神经干细胞具有更多的优势：(1)永生化神经干细胞较普通干细胞具有良好的安全性，研究表明移植治疗中，永生化的细胞在移植体中与组织地嵌合十分完整;(2)移植治疗当中不需要特殊的免疫反应药物，不引起免疫反应;(3)永生化细胞作为基因治疗的靶细胞时，较普通干细胞更具有稳定性，基因表达更具备高效性;(4)目前研究表明利用药物控制的永生化神经干细胞表达系统，可调节被施加外源性作用因子调节的转移基因的表达;(5)永生化神经干细胞可控性较普通神经干细胞有较大地提高;(6)符合伦理道德。尽管，永生化神经干细胞的建立，为神经系统疾病治疗带来了新的希望，但我们也应该意识到正常细胞的基因组以及某些遗传性状被改变之后才能制备成永生化细胞，对其应用价值有待于进一步评价。
2 神经干细胞研究的问题与展望
综上所述，基因修饰等技术构建的工程化神经干细胞能显著提高移植治疗中枢神经系统疾病的效果。但是，目前利用基因工程技术构建的神经干细胞，在的移植治疗技术中尚属开端，其仍然面临各种的难题：(1)中枢神经系统疾病的复杂较为特殊，在治疗过程的当中需要多种基因的参与，一种或两种基因的参与难以完成;(2)针对永生化神经干细胞，它是由正常细胞的基因组以及某些遗传性状被改变之后才被制备而成的，对其生理机制及应用价值有待进一步研究与评估;(3)研究用神经干细胞大部分经胚胎干细胞培养而来，其来源尚有理论争议;(4)工程化神经干细胞在移植入人体后，其存活、分化、迁移通过何种指标能够明确显示，这还需要进一步的研究。总之，工程化神经干细胞的前途是美好的，它在治疗中枢神经系统疾病发面的价值终会得到体现。
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