本科生专业毕业论文

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【摘 要】

目的研究还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤的影响。方法建立心肌细胞A/R损伤模型，随机分为5组：A组，正常对照组;B组，单纯缺氧/复氧(A/R低氧2h，复氧1h)组;C、D、E组为还原型谷胱甘肽处理组，加入还原型谷胱甘肽(GSH)分别使其终浓度为40、80、160mg/L，后A/R。于复氧后测定各组培养液中乳酸脱氢酶(LDH)变化及细胞内丙二醛(MDA)含量和细胞存活率。结果与正常组相比，单纯低氧/复氧组LDH漏出量、MDA水平显著升高(P<0.01)，细胞存活率显著降低(P<0.01)。与缺氧/复氧组比较，各谷胱甘肽处理组上述变化明显减轻(P<0.05)。结论还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞A/R损伤具有保护作用，并具有浓度依赖性。

【关键词】

还原型谷胱甘肽,心肌细胞,缺氧,复氧

1材料与方法

1.1材料实验用1～3天的Wistar大鼠乳鼠，山东大学实验动物中心提供，雌雄不拘;DMEM培养基由爱博公司出品;胎牛血清为美国Gibco公司出品;胰酶为Sigma公司出品;丙二醛(MDA)，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒均购自南京建成生物研究所;还原型谷胱甘肽(古拉定)由LaboratorioFarmaceuticoC.T.S.R.1生产(批号：4027)。

1.2乳鼠心肌细胞培养无菌取出生1～3天大鼠乳鼠心脏，剪碎后用0.25%胰酶消化4～5次，取除第1次以外的上清，用含15%胎牛血清的高糖DMEM中止消化，离心取心肌细胞沉淀，加入培养液，集中混匀制成悬液，应用差速贴壁法分离纯化心肌细胞，以5×105/ml的培养密度接种于24孔培养板中，在CO2培养箱中培养，48h后换液。

1.3实验分组及操作程序试验分为5组，每组重复8孔，A组为正常对照组(培养板置培养箱中持续孵育3h结束实验);B组为单纯缺氧/复氧组(A/R缺氧2h，复氧1h)：将培养板置于充有99.5%氮气的缺氧孵育器中37℃密闭培养2h，再以95%氧气+5%二氧化碳进行复氧1h;C组，D组，E组为古拉定处理组，加入古拉定使其终浓度分别为40、80、160mg/L。各组缺氧前、复氧前均给药。

1.4实验检测指标(1)计数细胞搏动：在倒置显微镜观察并计数心肌细胞搏动的频率及节律。(2)细胞存活率计数：采用台盼蓝排斥法检测，各组取少许细胞混悬液，0.4%台盼蓝混匀2min，按白细胞计数法在光镜下计数蓝染细胞。台盼蓝摄取率=蓝染细胞/(蓝染细胞+未蓝染细胞)×100%。(3)LDH及MDA活性及含量测定：实验结束后按试剂盒说明测定。

1.5统计学方法数据以均数±标准差(x±s)

2结果

2.1古拉定对缺氧/复氧心肌细胞搏动的影响正常培养对照组心肌细胞搏动相对恒定，节律规则;A/R组心肌细胞搏动频率减慢，搏动幅度减弱，节律不齐，有部分停搏，与对照组相比，差异有非常显著性(P<0.01);各古拉定处理组明显逆转A/R损伤造成的搏动频率和节律异常，与A/R组比较差异有显著性(P<0.05)。

2.2古拉定对心肌细胞缺氧/复氧损伤LDH及MDA的影响结果表明，A/R心肌损伤是十分明显的，而古拉定能明显减轻这种损伤，古拉定处理组各观察指标均差异有显著性，因此提示古拉定对于缺氧/复氧心肌细胞损害具有保护作用，且存在量效关系。

3讨论

3.1还原型谷胱甘肽对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响大量研究表明，缺血再灌注期间大量氧自由基的产生可造成细胞损伤。氧自由基导致细胞损伤主要环节为作用于细胞外基质，使胶原和透明质酸崩解，使膜磷脂结构的多聚不饱和脂肪酸过氧化而直接损伤细胞膜;肌浆网和线粒体崩溃，心肌细胞在缺氧缺糖条件下，ATP产生减少，代谢障碍，代谢产物堆积，使膜稳定性降低，溶酶体释放，导致生物损伤、变性，使LDH释放在培养基中，同时再给氧时氧自由基增加，细胞膜受攻击，细胞膜损伤。

细胞内LDH进一步增加，故LDH释放量是观测缺血再灌注损伤重要指标。脂质过氧化产物丙二醛(MDA)，其含量变化可作为评定自由基生成及对膜脂质双层结构破坏的指标。本实验从培养的未成熟鼠心肌细胞入手，排除了在体和离体灌注模型中神经、体液因素及其他混杂细胞因素的影响，直接利用还原型谷胱甘肽处理培养的未成熟鼠心肌细胞，结果发现还原型谷胱甘肽各浓度组均可降低缺氧/复氧损伤造成的心肌细胞死亡率，减少细胞内LDH漏出，减少细胞内MDA生成，且存在量效关系，表明还原型谷胱甘肽对未成熟鼠心肌细胞有保护作用。

3.2还原型谷胱甘肽对缺氧/复氧心肌细胞损伤的保护机制还原型谷胱甘肽(GSH)对清除自由基有重要作用，它是机体内一种重要的抗氧化剂，它能有效清除氧化产生的自由基，维持细胞内环境的稳定，并在使暴露于氧化环境的组织免受自由基损害方面起重要作用。GSH在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的作用下对有机过氧化物(ROOH)和无机过氧化物(H2O2)起重要清除作用，其还可以起维生素C还原剂的作用，使维生素C成为还原型而不断清除超氧自由基。

近期有研究表明，GSH可维持线粒体内膜巯基基团的还原状态。当GSH含量下降，内源性自由基攻击线粒体蛋白巯基的可能性增大，一方面使酶活性降低，影响线粒体氧化代谢的3个关键酶及电子传递链中酶的活性，NADH减少，ATP产生减少。另一方面，导致膜蛋白巯基氧化交联，构型改变，线粒体膜渗透性转运通道打开，钙释放增加，胞浆钙上升，激活细胞膜PLA2和中性蛋白水解酶(CANP)，导致细胞膜的损伤或死亡。本实验表明补充外源性GSH，对保护细胞膜的功能可能具有重要意义，对临床各种疾患造成的心肌细胞缺氧/复氧损伤有保护作用。

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